數(shù)字PCR技術(shù)服務(wù)
數(shù)字 PCR 的特征
1. 稀有變異檢測（Rare variant detection）
從外周血內(nèi)獲得分子生物標(biāo)記物、進(jìn)行特異突變篩查、監(jiān)測病程是醫(yī)療保健的一個(gè)發(fā)展
方向。這要求檢測體系(探針和引物)必須保證能在高背景野生型等位基因存在的條件下檢測
到低豐度的突變基因。由于數(shù)字PCR 降低了對反應(yīng)擴(kuò)增效率的要求，采取終點(diǎn)法判讀的方
法，數(shù)字PCR 可以很好的勝任稀有變異檢測的工作，同時(shí)也減少了引物設(shè)計(jì)過程中由于擴(kuò)
增效率不合要求而造成的浪費(fèi)(時(shí)間、樣品、耗材等等)。
2. 拷貝數(shù)變異（Copy-number variation）
雖然生殖系或體細(xì)胞拷貝數(shù)變化是否具有臨床意義需要取決于具體臨床情況，但 CNV
改變基因表達(dá)水平卻有十分重要的臨床意義。數(shù)字PCR 具有準(zhǔn)確性和精確性的特點(diǎn)，這使得其可以在CNV 研究中發(fā)揮重要的作用。在有已知拷貝數(shù)的內(nèi)參基因的前提下，數(shù)字PCR
不但可以清晰區(qū)分一個(gè)或者兩個(gè)拷貝，更可以對多拷貝基因進(jìn)行分析，例如，五個(gè)或者六個(gè)
拷貝。在這一點(diǎn)上，相比于包括qPCR 在內(nèi)的常規(guī)方法，數(shù)字PCR 優(yōu)勢明顯。
3 樣本需求量低（Minimal template requirements）
數(shù)字 PCR 的一個(gè)主要優(yōu)勢是所需樣本量很低，這對于一些臨床樣本來說特別重要，尤
其是樣本珍貴或者樣本核酸存在降解的情況下。目前很多基因組研究方法，例如CGH 芯片、
二代測序等，在實(shí)驗(yàn)之前都需要對有限的臨床樣本進(jìn)行擴(kuò)增以保證達(dá)到實(shí)驗(yàn)樣本量的要求。
然而，實(shí)際情況是，預(yù)擴(kuò)增會(huì)引入偏向（bias），無法保證不改變樣本內(nèi)待測基因的相對豐
度，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的嚴(yán)重程度取決于不同的應(yīng)用。
數(shù)字 PCR 樣本需求量低的特性可以避免由于預(yù)擴(kuò)增所引入的實(shí)驗(yàn)誤差，更好的實(shí)現(xiàn)實(shí)
驗(yàn)的精準(zhǔn)性和可靠性。
4 分析便捷（Ease of Analysis）
數(shù)字 PCR 有或無的結(jié)果判讀非常簡潔。對于相對定量分析來說，只需使用泊松原理將
陰性/陽性微滴的比例轉(zhuǎn)換成表達(dá)豐度、使用一個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行均一化后即可完成分
析。
5 與二代測序整合（Integration with next generation sequencing protocols）
如何在臨床領(lǐng)域發(fā)揮 NGS 的巨大優(yōu)勢是一個(gè)重要的問題。數(shù)字PCR 是一項(xiàng)非常有用
的互補(bǔ)型技術(shù)。例如：使用數(shù)字PCR 檢測患者特異性標(biāo)記物，與腫瘤配對末端測序?qū)嶒?yàn)結(jié)
果進(jìn)行相互驗(yàn)證，并且可以進(jìn)行NGS 文庫的制備和定量。
目前很難確認(rèn)什么樣的 NGS 結(jié)果是臨床所需要的，通常來說NGS 篩選到的變異或異常還需要使用經(jīng)典的Sanger 測序進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)字PCR 的出現(xiàn)，可以為NGS 發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)
行有效驗(yàn)證提供一個(gè)非常好的實(shí)驗(yàn)思路與平臺(tái)。
1. 突變/稀有變異檢測（Mutation/rare variant detection）
隨著伊馬替尼（imatinib）在bcr-abl 陽性的慢性粒細(xì)胞白血病上的成功應(yīng)用，越來越多
的科學(xué)家將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至生物標(biāo)記物的開發(fā)及基于特異基因的靶向治療。數(shù)字PCR 已經(jīng)
成功的應(yīng)用于腫瘤組織內(nèi)的EGFR 檢測以及EGFR 突變頻率的分析。
是否能夠開發(fā)出有效的靶向治療藥物，與突變基因的檢測密切相關(guān)。其中（1）攜帶藥
物作用突變位點(diǎn)的癌細(xì)胞百分比；（2）突變的特定等位基因是否可以被準(zhǔn)確檢測到，這兩
點(diǎn)都直接影響到靶向治療是否有效。很顯然，在腫瘤均質(zhì)細(xì)胞內(nèi)檢測單一突變相對簡單，但
是如果在異質(zhì)組織內(nèi)，在僅存有少量突變存在的情況下，如何準(zhǔn)確檢測出突變/稀有變異，
或者針對于同一種癌癥中多種亞克隆的準(zhǔn)確鑒定，對個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。
最近的一項(xiàng)研究表明，數(shù)字PCR 在進(jìn)行突變/稀有變異檢測中發(fā)揮著重要的作用。使用
NGS 對于肝癌的一個(gè)抑癌基因進(jìn)行篩查，30 倍覆蓋全基因組篩查并沒有檢測到該基因，但
76 倍覆蓋的成對外顯子篩查卻可以檢測到。后續(xù)使用傳統(tǒng)毛細(xì)管測序進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果也不
能確認(rèn)。然而使用數(shù)字PCR 可以輕松的檢測到該突變，而且精準(zhǔn)的確認(rèn)該突變的突變頻率
為13.2%。因此，對于突變等位基因的研究來說，研究平臺(tái)的靈敏度和準(zhǔn)確性是未來的研
究開發(fā)焦點(diǎn)所在。
數(shù)字 PCR 的另外一個(gè)潛在的重要應(yīng)用是通過檢測患者外周血樣對進(jìn)入外周循環(huán)的的腫
瘤組織核酸進(jìn)行分析。數(shù)字PCR 技術(shù)可以直接忽略預(yù)擴(kuò)增的環(huán)節(jié)直接進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，
相比于傳統(tǒng)的PCR 檢測方法，有更高的靈敏度。而且更令人鼓舞的是，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明，
微滴式數(shù)字PCR 可以實(shí)現(xiàn)1:100,000 的突變頻率篩查。
同樣的，在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查領(lǐng)域，也已經(jīng)有研究證明可以通過數(shù)字PCR 的方法可以對游
離在孕婦外周血內(nèi)的胎兒DNA 進(jìn)行準(zhǔn)確分析，用來檢測嬰兒的21 號(hào)染色體三體。這表明，
在未來數(shù)字PCR 可能會(huì)取代NGS 實(shí)現(xiàn)臨床21 三體的無創(chuàng)篩查。
在轉(zhuǎn)化移植領(lǐng)域，數(shù)字 PCR 也發(fā)揮著重要的作用，有數(shù)據(jù)證明，數(shù)字PCR 可以在心
臟移植受體患者外周血內(nèi)檢測到供體特異DNA。這對移植后排異反應(yīng)的跟蹤和預(yù)估提供了
很好的科研證據(jù)。
總的來說，數(shù)字 PCR 雖然不能發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，但卻是對于臨床樣本生物標(biāo)志物
定量分析的不二之選。
2. 藥理學(xué)（Pharmacogenetics）
有研究表明，不但體細(xì)胞變異會(huì)影響治療藥物的選擇，生殖細(xì)胞特定基因的變異對特定
處方的選擇也會(huì)有直接的影響。有一些點(diǎn)突變或者SNP 位點(diǎn)可能會(huì)影響藥物代謝；還有一
些情況下一些特異位點(diǎn)的CNV 可以預(yù)測藥物對個(gè)體的療效。在未來，通過數(shù)字PCR 技術(shù)，
我們可以獲得更多關(guān)于生殖細(xì)胞CNV 對藥理學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
3. 基因表達(dá)分析（Gene expression analysis）
除了常規(guī)的基因表達(dá)分析以外，數(shù)字 PCR 特別適用于單細(xì)胞或少量細(xì)胞的基因表達(dá)譜
分析，這是對臨床生物標(biāo)志物篩選和鑒定的很好探索。最近，有一些科學(xué)家開始著眼于非編
碼RNA（non-coding RNA, ncRNA），尤其是其中的亞類-microRNAs。從原理上來講，使
用數(shù)字PCR 進(jìn)行microRNA 的分析更為可行，同時(shí)，在ncRNA 的篩選和鑒定領(lǐng)域，數(shù)字
PCR 也可以與NGS 互為補(bǔ)充，互為印證，推動(dòng)這一領(lǐng)域的發(fā)展。
數(shù)字PCR 與二代測序(NGS)/全基因組測序的關(guān)系
在過去的三年內(nèi)，二代測序技術(shù)飛速發(fā)展，NGS 的巨大數(shù)據(jù)信息和并行樣本處理能力
可以用來進(jìn)行CNV 的預(yù)測。數(shù)字PCR 是一個(gè)很好的平臺(tái)，可以與NGS 平臺(tái)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)
行相互印證。數(shù)字PCR 平臺(tái)可以進(jìn)行精準(zhǔn)的絕對定量分析，極佳的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，而且樣本
需求極低。而且，數(shù)字PCR 的平臺(tái)可以很好的整合真?zhèn)�實(shí)驗(yàn)流程，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)測序、個(gè)體生
物標(biāo)志物開發(fā)、化療后外周血檢測的完整研究路線。
總之，數(shù)字PCR 是一個(gè)全新的絕對定量方式，整合了目前成熟發(fā)展的數(shù)字PCR 技術(shù)，
帶來了前所未有的精確性和靈敏度，開啟了一場核酸定量技術(shù)的革命。在未來，數(shù)字PCR
在分子診斷領(lǐng)域會(huì)發(fā)揮更大的作用，對于臨床診斷領(lǐng)域分子生物標(biāo)志物的篩選及驗(yàn)證發(fā)展會(huì)
有巨大的促進(jìn)。
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