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分子生物學(xué)常用實驗方法介紹

總RNA的提�。═rizol法提�。�

在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。

1. 提取組織RNA時，每50～100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10 ╳10⁶個細胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；
2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘；
3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘后，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘；
4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘；
5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；
6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。                       

PCR

實驗室常用DNA聚合酶有三種：TaKaRa Taq^TM，TaKaRa E_XTaq^TM和Pyrobest^TM DNA Polymerase。TaKaRa Taq^TM是一般的DNA聚合酶，保真性較差，但價錢便宜，一般用于基因表達的檢測等。TaKaRa E_XTaq^TM是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴增得到的PCR產(chǎn)物3’端附有一個“A”堿基，如果希望直接將產(chǎn)物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest^TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，其特點是保真性極高，擴增得到的PCR產(chǎn)物為平滑末端。如果進行基因的擴增請使用此酶。

1. 按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液：

TaKaRa Taq^TM或TaKaRa E_XTaq^TM的配方

Pyrobest^TM DNA Polymerase的配方

• 反應(yīng)總體積根據(jù)實際情況進行調(diào)控，可以做20~50µl以節(jié)約試劑；
• 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；
• 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 ~50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)；
• 按以下程序進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實際操作中需根據(jù)具體的情況以及PCR結(jié)果而進行優(yōu)化。

反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。

RT-PCR

Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)

1. 按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液

1. 反應(yīng)總體積根據(jù)實際情況進行調(diào)控，可以做20~50µl以節(jié)約試劑；
2. 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；
3. 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 ~50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)；
4. 按以下條件進行反應(yīng)

反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。

瓊脂糖核酸電泳

1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；
2. 根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般20~30 ml）；
3. 放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；
4. 室溫下30~45分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；
5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；
6. 在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；
7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣孔的一端為負)。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；
8. 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；
9. 電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產(chǎn)物的大小。

膠回收純化DNA

1. 瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；
2. 按照每100mg加400µl的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，45℃～55℃溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大概要5分鐘）；
3. 取出純化柱，將上述溶解液轉(zhuǎn)移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；
4. 加500µl的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液；
5. 重復(fù)操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；
6. 將純化柱放入一個新的EP管。加30~40µl H₂O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7. 注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的binding buffer,其余的步驟不變。

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取（堿裂解法）

此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。

1. 取1.5ml細菌培養(yǎng)物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細菌沉淀盡量干燥；
2. 將細菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，劇烈振蕩；
3. 加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個內(nèi)表面與溶液II接觸，不要渦旋，置于冰浴中；
4. 加入150 µl預(yù)冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H₂O)，蓋緊EP管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3~5分鐘；
5. 在最大轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液于另一新EP管；
6. 用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放置2分鐘，最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘；
7. 小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；
8. 加1ml 70％乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發(fā)，直至EP管中內(nèi)沒有可見的液體存在（5～10分鐘），用適量的ddH₂O溶解；
9. 用0.5µl的RNase 37℃溫育5~10分鐘；
10. 電泳鑒定。

乙醇沉淀DNA

1. 加入1/10體積的乙酸鈉（3 mol∕L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其最終濃度為0.3 mol∕L；
2. 加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃中15~30分鐘；
3. 12,000 g離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
4. 加入1/2離心管容量的70％乙醇，12000g離心2分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
5. 于室溫下將開蓋的EP管的置于實驗桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干；
6. 加適量的ddH₂O溶解DNA沉淀。

酶  切

1. 酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套Buffer。
2. 在離心管中加入如下成分：

10×Buffer  1μl

待切樣品  xμl

酶        0.5-1μl 

加水補足10μl

1. 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。
2. 將離心管置于37℃中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時間適當(dāng)延長。
3. 用未酶切的質(zhì)粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。

注：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時，可按比例適當(dāng)加大反應(yīng)體積。雙酶切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反應(yīng)。）

連 接

1. 連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。
2. 在離心管中加入如下成分：

10×連接Buffer 1μl

待連接的樣品（膠回收產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，載體與片段的mol比為1∶3-5）

連接酶0.5-1μl 

加水補足10μl

1. 混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。
2. 將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當(dāng)?shù)臅r間（根據(jù)不同公司的酶的要求而定，一般為22℃ 1-3hr或16℃連接過夜）。

連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化，也可放4℃冰箱短期保存。

感受態(tài)細胞的制備

1. 挑取適當(dāng)菌株的E.coli單菌落接種于2ml SOB培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜。
2. 取0.5-1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50ml SOB中，18℃劇烈震蕩，直到A₆₀₀達到0.6。
3. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，4℃ 4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。
4. 棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。
5. 取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15ml TB（1/3體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min離心10min。
6. 棄上清，沉淀重懸于4ml TB（1/12.5體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10min。
7. 加入280μl  DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。
8. 將菌液分裝于EP管中，-80℃或液氮凍存。
9. 取兩管感受態(tài)細胞分別加入1μl無菌ddH₂O（陰性對照）和1μl純質(zhì)粒（陽性對照）進行轉(zhuǎn)化（見后），以檢測感受態(tài)的質(zhì)量。陰性對照平板上應(yīng)該無菌落生長，陽性對照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。

SOB的配制：

蛋白胨        20g

酵母提取物    5g

NaCl          0.58g

KCl           0.186g

100×Mg⁺⁺溶液10ml

溶解并加水定容至1L，121℃×20min高壓蒸汽滅菌

100×Mg⁺⁺溶液：  

MgCl₂﹒6H₂O

MgSO₄﹒7H₂O

溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高壓蒸汽滅菌

TB溶液的配制：

   1M  KCl                       5ml

0.55M MnCl₂                    2ml

0.5M  CaCl₂                    0.6ml

0.1M K-Pipes(pH 6.7)             2ml

ddH₂O                         10.4ml

Total                         20ml

注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理

0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：

     稱取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H₂O中，此時粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固體調(diào)節(jié)PH值，只有當(dāng)PH接近6.7時粉末才能完全溶解，此時當(dāng)小心少量地加入KOH直至達到所需PH值。

轉(zhuǎn) 化

1. 取100μl感受態(tài)細胞于冰浴上融化。
2. 加入1μl純質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物，輕輕吹打混勻，冰浴30 min。
3. 將菌液放入42℃水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2 min。
4. 加入0.9ml SOC，于37℃恒溫搖床上200rpm×1hr溫育。
5. 將菌液4000rpm/min離心3min，留200μl上清將菌體打散，均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的瓊脂平板表面，平板于37℃倒置培養(yǎng)過夜。
   1. 注：新倒的平板可于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)先放置數(shù)小時至過夜干燥。
   2. 當(dāng)轉(zhuǎn)化的是TA克隆連接產(chǎn)物時可在菌液中加入8μl1M IPTG和40μl  20mg/ml X-gal以進行藍白斑篩選。

重組子的篩選和鑒定

重組子可通過酶切進行鑒定，也可以利用擴增引物通過PCR進行鑒定，陽性重組子能切出所需要的片段或得到相應(yīng)片段的PCR產(chǎn)物。

1. 用牙簽挑取平板上的菌落接種于2ml含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。
2. 次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min離心，棄上清，加入20μl  ddH₂O和20μl酚/氯仿，震蕩混勻，13,000rpm×5min離心。
3. 取上清進行瓊脂糖電泳，加入載體質(zhì)粒DNA作為陰性對照，根據(jù)質(zhì)粒大小初步篩選重組子，重組子的泳動速度應(yīng)該慢于載體質(zhì)粒。
4. 用堿法小量制備可能是重組子的質(zhì)粒DNA。
5. 選取適當(dāng)?shù)拿福瑢χ亟M子進行酶切分析，酶切體積均為10μl體系。酶切樣品進行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。
6. 酶切分析正確的重組子分成兩份，一份進行測序反應(yīng)，另外一份保種。
7. 若用PCR法鑒定，則在第2步時每個樣本取0.5-1.0μl 菌液為模板進行PCR反應(yīng)，每管反應(yīng)體系最低可少至10μl，PCR產(chǎn)物電泳，能得到所需條帶的樣本進一步提取質(zhì)粒酶切鑒定或送樣品測序。

真核細胞的轉(zhuǎn)染

該操作以Invitrogen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE為例，其它轉(zhuǎn)染試劑可參照各自的使用說明書進行。

1. 在6孔板中接種1-3×10⁵細胞/孔，加入2ml完全培養(yǎng)基，置CO₂孵箱中37℃培養(yǎng)過夜。
2. 待細胞長到50-80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液：
   1. 溶液A：將1-2μg待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到100μl無血清培養(yǎng)基中
   2. 溶液B：將2-25μl  LipofectAMINE稀釋到100μl無血清培養(yǎng)基中
3. 混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。
4. 用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO₂孵箱中37℃孵育2-24hr。
5. 用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)。
6. 24-72hr后檢測蛋白質(zhì)的表達或傳代并加入選擇性抗生素以篩選穩(wěn)定表達株。

轉(zhuǎn)染細胞的穩(wěn)定篩選

1．確定抗生素作用的最佳濃度：

不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗，確定抗生素對所選擇細胞的最低作用濃度。

1. 提前24小時在96孔板或24孔板中接種細胞8孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO₂孵箱中37℃培養(yǎng)過夜。
2. 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/ml）。
3. 培養(yǎng)10-14天以絕大部分細胞死亡濃度為準,一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達克隆時可比該濃度適當(dāng)提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.

2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進行。

3．轉(zhuǎn)染72小時后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細胞在6孔板中傳代，換為含預(yù)試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6孔板內(nèi)可見單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。

1. 濾紙片法：用消毒的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細胞集落上10-15秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于24孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細胞在24孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm²培養(yǎng)瓶中,長滿后再轉(zhuǎn)入75cm²培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
2. 有限稀釋法：將細胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋（10^-2—10^-10），將每一稀釋度的細胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，7-10天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。

4. ELISA或Western blot檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。                                                   

重組蛋白質(zhì)的表達、純化、復(fù)性和定量

按Qiagen公司的操作手冊進行，具體步驟如下。

一、重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達

1. 挑取轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml 選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)過夜。
2. 次日將培養(yǎng)過夜的菌液500 μl再接種于10 ml（1:20）選擇性LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)至光密度（OD₆₀₀=0.6）時，取1 ml樣本作為誘導(dǎo)前標本，10000g離心1 min收集菌體沉淀，－20 ^oC凍存?zhèn)溆谩?
3. 加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG終濃度為1 mM，37^oC，250 rpm/min振搖培養(yǎng)4～5小時。取1 ml樣本作為誘導(dǎo)后標本，同上法收集菌體沉淀，－20 ^oC凍存?zhèn)溆谩?
4. 將誘導(dǎo)前后菌體沉淀用20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸加熱5 min，SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，考馬斯亮藍染色3小時后，脫色觀察結(jié)果。
5. 選取誘導(dǎo)成功的細菌克隆，擴大誘導(dǎo)規(guī)模，收集菌體沉淀，于－20^oC保存，準備做下一步分析及純化。

二、重組蛋白質(zhì)的分離純化

重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定

1. 將按上法誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集的菌體重懸于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在－80^oC低溫冰箱中放置10 min。
2. 冰中解凍。
3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌6次，每次10 sec，間歇10 sec，電壓200-300 V。
4. 10000g，4^oC，離心20 min，取上清（為溶液A），－20^oC保存；另將沉淀用同樣裂解液1溶解（為溶液B），同樣－20^oC保存，供后繼分析使用。
5. 將上述A、B溶液和誘導(dǎo)前后的細菌進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。如果誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)位于A溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在B溶液中，則為非可溶蛋白。

重組蛋白質(zhì)為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化

1. 將菌體沉淀溶于適量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。
2. 10000g，4 ^oC，離心30 min，收集上清液。
3. 將Ni-NTA Agarose充填柱子，并連接于Pharmarcia低壓液相層析系統(tǒng)，用5倍柱體積的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，調(diào)節(jié)A₂₈₀值至零線。
4. 將適量上清液上樣到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer沖洗至A₂₈₀值低于0.01。
5. 分別用5～10倍柱體積的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至A₂₈₀值低于0.01。
6. 用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質(zhì)，在A₂₈₀值監(jiān)測下，收集出現(xiàn)峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。

三、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、凍干和定量

純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用0.01×PBS透析，透析后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標準，采用BIO-RAD公司蛋白質(zhì)定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質(zhì)的含量。